假结核耶尔森菌PCR检测试剂盒说明书

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注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行设立一个的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。
组成及试剂配制:
1、酶标板：一块（96孔）
2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液：1×20ml。
4、 检测稀释液A：1×10ml。
5、 检测稀释液B：1×10ml。
BGPNα-苯甲酰-L-精氨酸 98.5%葛根素 98%

α-Glycerophosphate disodium salt hexahydrate4-硝基-L-苯氨酸 98%黄藤素 97%

DL-α-Glycerol phosphate magnesium salt hydrate4-硝基-D-苯氨酸 99%拟人参皂苷F11 分析标准品，≥98%

Paraffin oil4-硝基-DL-苯氨酸 98%安石榴苷  98%

Lileic acidNeuromedin C ≥97% (HPLC)根皮苷,二 98%

Oleic acid美拉诺坦 ≥95% (HPLC)异槲皮苷 98%

5-FOAD-鸟氨酸盐酸盐 99%D-(-)-奎尼酸 98%

Shikimic acidN'-Cbz-L-鸟氨酸 98%金丝桃苷 分析标准品，≥98%

Palmitoleic acidL(+)-2,3-二氨基氨酸盐酸盐 97%槲皮素 97%

CyDTAL-鸟氨酸盐酸盐 98%白藜芦 99%

PABAN-叔丁氧羰基-N'-苄氧羰基-D-鸟氨酸  98%吴茱萸次碱 98%

PABA sodium saltN-芴甲氧羰基-(N'-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-LL-鼠李糖，一 99%

4-Amibenzenesulfonic acidL-鸟氨酸甲酯  99%(+)-芸香苷，三 97%

Maleic acid5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)胸苷 98.0%迷迭香酸 97%

Maleic acid sodium saltOxime Resin 0.3~0.8mmol/g, 100~200 mesh, 1% DVB左旋延胡索乙素 分析标准品，≥98%（HPLC)

Sulfamic acidOrexin A human, rat, mouse ≥97% (HPLC)红景天苷  分析标准品，≥97.5%(HPLC)

2-甲基四(MeTHF)(Standard for GC,≥99.5%(GC))Brg1 (P680) AntibodyMenin/Men1  Menin抑癌蛋白抗体

异戊烷(Standard for GC,≥99.7%(GC))MLH1 (4C9C7) Mouse mAbmembrane glycoprotein E(VZV)  人痘带状疱疹病毒gE蛋白抗体

烯酸甲酯（MA）(Standard for GC,>99%(GC))MLH1 (4C9C7) Mouse mAbMelama HMB45/Melama/Melan-A/MART-1  黑色素瘤相关抗原/黑色素-A抗体

丁酸甲酯(Standard for GC,>99.5%(GC))Phospho-NPM (Thr95) AntibodyMelamine(1B12)  三聚胺单克隆抗体

α-甲基烯酸(Standard for GC)Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (PE Conjugate)Melamine  三聚胺抗体

乙二甲(standard for GC,>99.7%(GC))Phospho-Keratin 17 (Ser44) AntibodyMelamine  三聚胺抗体

N-甲基吡咯烷酮（NMP）(standard for GC,≥99.6%(GC))Phospho-NPM (Ser4) (D19C1) XP® Rabbit mAbMelamine  三聚胺抗体

异丁(standard for GC,≥99.5%(GC))Phospho-NPM (Ser4) (D19C1) XP® Rabbit mAbMel18/ZNF144  锌指蛋白蛋白144抗体

甲基环己烷(Standard for GC,≥99.8%(GC))Phospho-MDM2 (Ser166) AntibodyMEK6  丝裂原活化蛋白激酶MKK6抗体

乙酸甲酯(GCS,≥99.9% (GC))Phospho-PNK1 (Ser114/Thr118) AntibodyMEK5/MAP2K5  丝裂原活化蛋白激酶激酶5抗体
假结核耶尔森菌PCR检测试剂盒说明书G蛋白偶联受体GPR91蛋白抗体Taxoquine中文名：别名：分子式：C20H28O4

特异性囊肿病液体蛋白15抗体Danshenxinkun A中文名：丹参新醌甲别名：Danshexinkun A分子式：C18H16O4

生长抑制DNA损伤基因GADD45β抗体Przewaquine A中文名：紫丹参甲素别名：分子式：C19H18O4

G蛋白偶联受体39抗体Deoxyneocryptotanshine中文名：别名：分子式：C19H22O3

细胞生长抑制蛋白22抗体（甲基化控制J蛋白）甾体