大鼠ELISA试剂盒试验老是失败的几个因素

更新时间：2022-11-14

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　　大鼠ELISA试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的抗原会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物s化物的抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗体与结合在包被抗体上的抗原结合、生物s与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗原浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中指标的浓度。

　　大鼠ELISA试剂盒试验时老是失败的几个因素分析：

　　一、低信号强度

　　如果ELISA读数低于吸光度下限，且目标样本浓度超出标准曲线范围，则进行分析的样本浓度可能太低，或者仪器所能分析的样本检测最佳条件可能未被满足。在这种情况下，样本所产生的检测信号应该需要被级联放大。

　　解决方案：

　　1.增加抗体的孵育时间。如果在室温下孵育您的抗体2小时后的实验结果并不理想，那么可以尝试在4℃孵育过夜。如此，可允许抗原抗体大程度上的结合，并能扩大ELISA中的反应信号。

　　2.增加二抗-酶结合物的浓度。ELISA中的E代表酶（通常是辣根过氧化物酶，HRP），它与底物（通常是TMB）反应后可产生鲜艳的蓝色。因而，将HRP浓度提高50％或将其加倍，则会产生更强的颜色，易于检测。

　　3.充分避光，以保护TMB基质不受光照影响，并确保其能最大限度地发挥其性能。考虑到TMB对光线非常敏感，因而在黑暗中进行ELISA平板的显色反应会产生更强的信号。

　　二、重复性不好

　　同一个样本间的各个复孔的读数有显著性差异。

　　解决方案：

　　1.加样量多少不一，操作时间长短不一。重复同一样本时，加样量与加样时间理应相同，同时也应注意移液器的校准。加样后可轻微晃动酶标板使反应液充分混合。

　　2.样本应保证一致、无污染，并应该由同一名操作人员进行操作。

　　3.精密度测定方法不标准，此时理应采用正确的方法进行操作。